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3種檢測(cè)吡咯喹啉醌的方法比較

發(fā)布日期:2022-12-2 14:45:41 瀏覽次數(shù):88


[摘要 ]研究和比較3種檢測(cè)吡咯喹啉醌(PQQ)的方法確定各種方法的特點(diǎn)和適用范圍。

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[關(guān)鍵詞吡咯喹啉醌 ;檢測(cè)方法;電泳法(NativePAGE 法);光譜法NBTGly 。

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)是20世紀(jì)70年代末發(fā)現(xiàn)的一種不同于吡啶核苷酸(NAD、NADP)和核黃素(FMN、FAD)的第三類輔酶。PQQ適合生物發(fā)酵法生產(chǎn)。為了簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)發(fā)酵液中的PQQ,我們?cè)O(shè)計(jì)并改進(jìn)了3種檢測(cè)方法:NativePAGE NativePAGE 法)、光譜法、和NBT-Gly法。

本文利用山梨脫氫酶與其專一性輔酶PQQ結(jié)合催化底物山梨糖的特性,設(shè)計(jì)了利用氯化硝基四氮唑藍(lán)染色體檢測(cè)NativePAGE PQQ的方法。

光譜法是以D326nm值與D400nm值來(lái)檢測(cè)PQQ的含量。

NBT-Gly法利用了PQQ的氧化還原特性,參照文獻(xiàn)加以改進(jìn),引入96孔板和酶標(biāo)儀,縮小了反應(yīng)體系,增加了一次檢測(cè)的樣品數(shù)量。

1 材料與方法

1.1 材料(具體見(jiàn)文獻(xiàn))

1.2 樣品制備(具體見(jiàn)文獻(xiàn))

1.3 分別用活性電泳檢測(cè)法、光譜法、NBT-Gly法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)限和線性范圍

利用PQQ標(biāo)準(zhǔn)品確定了3種方法的PQQ檢測(cè)限,活性電泳檢測(cè)可檢測(cè)出12.6ng/ml以上的PQQ含量;光譜法檢測(cè),當(dāng)△D326nm-400nm0-0.7時(shí),PQQ濃度與吸光度之間的線性關(guān)系良好,線性范圍為2.46-26.27μg /ml。NBT-Gly法的線性范圍為44.250ng/ml-1.416μg /ml,由于還原型NBT的不溶解性,高濃度時(shí)呈絮狀,導(dǎo)致吸光度值下降。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

考察了光譜法和NBT-Gly法的組內(nèi)精密度和組間精密度。在各方法的線性范圍內(nèi)選擇5個(gè)PQQ濃度,n=3。其具體數(shù)值見(jiàn)表1

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2.3 樣品檢測(cè)和加樣回收率

采用NativePAGE 檢測(cè)供試樣品時(shí),在同一塊聚丙烯凝膠上與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品相比3個(gè)樣品的PQQ含量大量為6.25-12.5μg /ml.NBT-Gly法和光譜法檢測(cè)樣品PQQ含量時(shí),在相同條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)回歸方程計(jì)算得到樣品的PQQ含量(表2、3)。在供試品中加入標(biāo)準(zhǔn)品,考察加樣回收率(n=3)(表23)。進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí),光譜法必須扣除培養(yǎng)基背景干擾,而其它兩法可忽略。

3  討論

NativePAGE PQQ 檢測(cè)下限為 12.6 ng / m L,靈敏度高,而且利用了 SDH 與輔酶和底物相互作用的特異性,抗干擾性強(qiáng),適于培養(yǎng)上清等復(fù)雜樣品的粗略定量。 但該法不能用于 PQQ 的準(zhǔn)確定量,因而未考察其精密度和加樣回收率。

光譜法在 PQQ 濃度為 26.27 μg /m L2.46 μg /m L 時(shí)與吸光度值呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系,精密度好。進(jìn)行發(fā)酵樣品上清中 PQQ 含量檢測(cè)時(shí),可將樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋,使 PQQ 含量落在光譜法的線性范圍內(nèi)。

NBTGly 法線性關(guān)系較好, 1.416 μg / m L44.250 ng / m L 時(shí)呈線性關(guān)系 , 但重復(fù)性不佳 ,RSD偏高,加樣回收率為 9964%~11968%。 NBTGly 法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便,一次可檢測(cè)多個(gè)樣品。

由于NativePAGE 檢測(cè)的靈敏度很高,在篩選 PQQ 產(chǎn)生菌時(shí),可先進(jìn)行NativePAGE 檢測(cè),確定是否含有PQQ,后用光譜法和 NBTGly 法進(jìn)行定量。 NBTGly 法操作簡(jiǎn)便,檢測(cè)量大,有利于從大量樣品中篩選高產(chǎn)菌株。光譜法精密度高,但在檢測(cè)樣品時(shí)會(huì)受到培養(yǎng)基的干擾,將 PQQ 純化后用此方法檢測(cè)可得到精確的 PQQ 濃度。

本文為PQQ檢測(cè)提供了3種簡(jiǎn)便易行的方法,不需要昂貴的儀器,操作過(guò)程簡(jiǎn)單,可根據(jù)實(shí)際需要選用。

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文獻(xiàn)

[1] 楊延新,熊向華,游松,張惟材.3種檢測(cè)吡咯喹啉醌的方法比較[J].生物技術(shù)通訊20112222):544-547

 

 


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