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3種檢測吡咯喹啉醌的方法比較

發(fā)布日期:2022-12-2 14:45:41 瀏覽次數:78


[摘要 ]研究和比較3種檢測吡咯喹啉醌(PQQ)的方法,確定各種方法的特點和適用范圍。

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[關鍵詞吡咯喹啉醌 ;檢測方法;電泳法(NativePAGE 法);光譜法NBTGly 。

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinonePQQ)是20世紀70年代末發(fā)現的一種不同于吡啶核苷酸(NAD、NADP)和核黃素(FMNFAD)的第三類輔酶。PQQ適合生物發(fā)酵法生產。為了簡單快速的檢測發(fā)酵液中的PQQ,我們設計并改進了3種檢測方法:NativePAGE NativePAGE 法)、光譜法、和NBT-Gly法。

本文利用山梨脫氫酶與其專一性輔酶PQQ結合催化底物山梨糖的特性,設計了利用氯化硝基四氮唑藍染色體檢測NativePAGE PQQ的方法。

光譜法是以D326nm值與D400nm值來檢測PQQ的含量。

NBT-Gly法利用了PQQ的氧化還原特性,參照文獻加以改進,引入96孔板和酶標儀,縮小了反應體系,增加了一次檢測的樣品數量。

1 材料與方法

1.1 材料(具體見文獻)

1.2 樣品制備(具體見文獻)

1.3 分別用活性電泳檢測法、光譜法、NBT-Gly法進行檢測。

2 結果

2.1 檢測限和線性范圍

利用PQQ標準品確定了3種方法的PQQ檢測限,活性電泳檢測可檢測出12.6ng/ml以上的PQQ含量;光譜法檢測,當△D326nm-400nm0-0.7時,PQQ濃度與吸光度之間的線性關系良好,線性范圍為2.46-26.27μg /ml。NBT-Gly法的線性范圍為44.250ng/ml-1.416μg /ml,由于還原型NBT的不溶解性,高濃度時呈絮狀,導致吸光度值下降。

2.2 精密度實驗

考察了光譜法和NBT-Gly法的組內精密度和組間精密度。在各方法的線性范圍內選擇5PQQ濃度,n=3。其具體數值見表1

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2.3 樣品檢測和加樣回收率

采用NativePAGE 檢測供試樣品時,在同一塊聚丙烯凝膠上與不同濃度的標準品相比,3個樣品的PQQ含量大量為6.25-12.5μg /ml.NBT-Gly法和光譜法檢測樣品PQQ含量時,在相同條件下制作標準曲線,通過回歸方程計算得到樣品的PQQ含量(表23)。在供試品中加入標準品,考察加樣回收率(n=3)(表2、3)。進行樣品檢測時,光譜法必須扣除培養(yǎng)基背景干擾,而其它兩法可忽略。

3  討論

NativePAGE PQQ 檢測下限為 12.6 ng / m L,靈敏度高,而且利用了 SDH 與輔酶和底物相互作用的特異性,抗干擾性強,適于培養(yǎng)上清等復雜樣品的粗略定量。 但該法不能用于 PQQ 的準確定量,因而未考察其精密度和加樣回收率。

光譜法在 PQQ 濃度為 26.27 μg /m L2.46 μg /m L 時與吸光度值呈現很好的線性關系,精密度好。進行發(fā)酵樣品上清中 PQQ 含量檢測時,可將樣品進行適當稀釋,使 PQQ 含量落在光譜法的線性范圍內。

NBTGly 法線性關系較好 1.416 μg / m L44.250 ng / m L 時呈線性關系 , 但重復性不佳 ,RSD偏高,加樣回收率為 9964%~11968%。 NBTGly 法的優(yōu)點是操作簡便,一次可檢測多個樣品。

由于NativePAGE 檢測的靈敏度很高,在篩選 PQQ 產生菌時,可先進行NativePAGE 檢測,確定是否含有PQQ,后用光譜法和 NBTGly 法進行定量。 NBTGly 法操作簡便,檢測量大,有利于從大量樣品中篩選高產菌株。光譜法精密度高,但在檢測樣品時會受到培養(yǎng)基的干擾,將 PQQ 純化后用此方法檢測可得到精確的 PQQ 濃度。

本文為PQQ檢測提供了3種簡便易行的方法,不需要昂貴的儀器,操作過程簡單,可根據實際需要選用。

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文獻

[1] 楊延新,熊向華,游松,張惟材.3種檢測吡咯喹啉醌的方法比較[J].生物技術通訊2011,2222):544-547

 

 


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