摘要:研究銀耳多糖的提取分離與純化
關(guān)鍵詞:銀耳多糖;純化
銀耳多糖是從銀耳子實(shí)體或液體深層發(fā)酵的銀耳孢子中提取出來的一種活性多糖,從椴木銀耳中提取分離得到的酸性銀耳多糖具有廣泛的藥理活性,具有提高機(jī)體免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗?jié)?、抗血栓形成、等作?/span>[1],能增強(qiáng)機(jī)體耐缺氧能力,清除自由基,能使人體產(chǎn)生抗體及干擾素。
1 材料、試劑與儀器
1.1 材料 椴木銀耳
1.2 試劑
2%的氫氧化鈉:10g氫氧化鈉加少量水溶解,定容至500mL,轉(zhuǎn)入試劑瓶保存?zhèn)溆?1%活性碳;稱取重蒸苯酚50g,定容至1000mg·mL- 1,配成5%的苯酚溶液,避光低溫保存待用;標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(0.1mg·mL- 1):100mg標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖定容至1000mL;硫酸,乙醇,丙酮,乙醚:均為AR級(jí);DEAE-C52;Sevage試劑:氯仿-正丁醇溶液;0.5mol·L- 1鹽酸:41.5mL鹽酸加水稀釋到1000mL,試劑瓶保存?zhèn)溆?2mol·L- 1 NaCl溶液500mL。
1.3 儀器
雙重蒸餾水蒸餾器,超級(jí)恒溫水浴,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52型,紫外可見分光光度計(jì)752N,低速大容量多管離心機(jī)LXJ-ⅡB型,透析袋,鋁鍋,攪拌器,天平,精密電子天平,電爐等。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 銀耳多糖的提取
將20g銀耳子實(shí)體和800mL水加入1000mL燒杯中,于沸水浴中加熱攪拌8h,離心去殘?jiān)?/span>(3000r/min,25min)。上清液用硅藻土助濾,水洗,合并濾液后于80℃水浴攪拌濃縮至糖漿狀。用2mol·L-1NaOH調(diào)至pH 7,加熱回流,用1%活性炭脫色,抽濾,濾液扎袋,流水透析48h。透析液離心(3000r·min-1,10min),上清液于80℃水浴濃縮至原體積的1/3。然后加入3倍量95%乙醇,攪拌均勻后,離心(3000r·min-1,15min),沉淀用無水乙醇洗滌2次,乙醚洗滌一次,真空干燥得銀耳多糖粗品。提取銀耳多糖的工藝流程(見圖1)。
2.2 銀耳粗多糖的純化
2.2.1 多糖液脫蛋白:
將粗多糖樣品溶于一定量的蒸餾水中,加入2/3體積的Sevage試劑(氯仿∶正丁醇= 5∶1,v/v),然后將其置于分液漏斗中充分振搖10min,靜置分層。分液除去蛋白質(zhì)沉淀后繼續(xù)加入Sevage試劑,重復(fù)3次。粗糖液蒸發(fā)濃縮,真空干燥得以進(jìn)一步提純的粗多糖樣品,供季銨鹽法(CTAB)沉淀用。
2.2.2 季胺鹽沉淀法提純粗多糖:
0.5g銀耳粗多糖溶于50mL水中,溶解后離心(3000r·min- 1,10min)去除相應(yīng)的沉淀,上清液加2%CTAB溶液至沉淀完全,搖勻,靜置4h,離心,沉淀用熱水洗滌3次,加100mL 2mol·L- 1 NaCl溶液于60℃解離4h,離心(3000r·min-1,10min),上清液流水透析12h。透析液于80℃水浴濃縮,加三倍量95%乙醇,攪拌均勻后,離心(3000r·min-1,10min),沉淀再分別用無水乙醇、乙醚洗滌,真空干燥,得精品銀耳多糖,測(cè)定多糖含量。
2.3 多糖含量測(cè)定
硫酸苯酚比色法測(cè)定糖含量:其原理是,糖在濃硫酸作用下,脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物,在10mg~ 100mg范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比,且在490nm波長(zhǎng)下有最大吸收峰,故可用比色法在此波長(zhǎng)下測(cè)定。此比色法方法簡(jiǎn)單,靈敏度高,實(shí)驗(yàn)時(shí)基本不受蛋白質(zhì)存在的影響,并且產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定160min以上。
2.3.1 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線:取5支潔凈的糖管,按表1操作。
表1: 糖含量測(cè)定操作表
2.3.2 樣品糖含量測(cè)定:配制0.1mol·L的樣品液(粗品和精品),分別取1ml于試管中,其他操作同上。
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 銀耳多糖的產(chǎn)量與產(chǎn)率(見表2)
表2 銀耳多糖純化前后產(chǎn)量與產(chǎn)率
3.2 多糖含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2、表3)
圖二:標(biāo)準(zhǔn)曲線
表3:多糖含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
3.3 樣品糖含量測(cè)定:樣品中粗品A=0.478,精品A=0.614.由回歸線方程A=1.1145C+0.0298得到粗品含糖0.495/0.1=50.5%;精品含量76.28%。
4 討論
本實(shí)驗(yàn)采用的是季銨鹽(CTAB)沉淀法提取粗多糖,其原理為:
長(zhǎng)鏈季胺鹽能與酸性多糖成鹽形成水不溶性化合物,可分離酸性及中性多糖。常用的季胺鹽是十六烷基三甲基溴化銨,是一種陽(yáng)離子去污劑,具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性,但其在高離子強(qiáng)度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物,卻不能沉淀核酸,所以我們?cè)谔崛°y耳多糖后先用Sevage試劑[2]去除溶液中蛋白質(zhì),再通過加入CTAB沉淀銀耳多糖,最后加入乙醇沉淀即可使多糖分離出來。一般地說,酸性強(qiáng)或分子量大的酸性多糖首先沉淀出來。
季銨鹽沉淀法純化效果較好,既經(jīng)濟(jì)又具有實(shí)用性,很適宜工業(yè)生產(chǎn)。在提取過程中可適當(dāng)加熱,溫度不宜高過60℃,且需要不斷的攪拌以使提取能夠充分。經(jīng)檢測(cè),粗品經(jīng)過CTAB法純化產(chǎn)率在37.4%,粗品中含糖50.5%。純化之后繼續(xù)檢測(cè)得到的產(chǎn)品,結(jié)果顯示產(chǎn)品含糖最高達(dá)76.28%。
文獻(xiàn)
[1] 聶偉,張永祥,周金黃.銀耳多糖的藥理學(xué)研究概況[J],中藥藥理與臨床.2000,16(4):44- 46.
[2] evag MG:Biochen Z:273:419.1994.
[3] 和偉珍,吳麗仙.銀耳多糖的提取分離與純化[J],海峽藥學(xué).2008,20(7):33-35.